卵內儲存的營養物質,主要由清蛋白、球蛋白、磷蛋白、卵磷脂及一些酶等組成,在胚胎發育過程中起著積極作用。鳥類、兩棲類和大多數魚類的卵黃發生有兩種來源:一是由卵母細胞本身合成,稱內源性卵黃;一是由卵母細胞以外的組織細胞合成,稱外源性卵黃,如脊椎動物由肝臟合成卵黃前體,再輸送至卵巢,由卵母細胞攝入。
作用
通過免疫注射產蛋雞,即可由其生產的蛋黃中提取相應的抗體,并可用于相應疾病的預防和治療,這類制劑稱為卵黃抗體。卵黃抗體在臨床上應用較為廣泛,其優點是雞蛋比動物血清更容易獲得,且卵黃中抗體含量較高。禽類的免疫器官法氏囊主要控制機體的體液免疫,機體的免疫應答發生后,體液中成熟的骨髓依賴性淋巴細胞受相關免疫信號通路的介導,分化為漿細胞,隨即產生大量抗體釋放入血液中。血液中的大量抗體逐漸轉移入卵黃中,并適量地蓄積。收集到的卵黃抗體,即為通過同一抗原反復刺激后產生的多克隆抗體。卵黃中主要的免疫球蛋白為IgY,其功能與作用類似于哺乳動物血清中的IgG。雞lgY的分子量約180k Da,由兩條輕鏈和兩條重鏈組成,分子量分別為60~70k Da和22~30k Da,等電點約為5.2。IgY具有較強的耐熱、耐酸、抗離子強度和一定的抗酶解能力。
卵黃中的主要成分是蛋白質和脂肪,其比例為1:2。大部分蛋白質都是脂蛋白,存在于卵黃顆粒中,不溶于水,只有卵黃球蛋白(α、β、γ)是水溶性的,而IgY是γ卵黃球蛋白。因此lgY的分離純化首先需要有效地去除卵黃中的脂類,從水溶性蛋白中分離IgY。目前已建立了諸如PEG、硫酸葡聚糖、天然膠,如海藻酸鈉、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步純化蛋白質。
實驗材料
1.健康產蛋雞(最好是SPF雞)、免疫抗原(如雞新城疫滅活疫苗)、弗氏佐劑。
2.滅菌生理鹽水或0.01mol/L pH7.2 PBS、海藻酸鈉、飽和硫酸銨等。
3.毛細滴管、注射器、碘酊棉、酒精棉、燒杯、玻璃棒、離心管、pH試紙等。
4.微量振蕩器、離心機、分光光度計等。
操作方法
1.實驗動物的選擇:選擇健康、產蛋率高的蛋雞,購進后飼養1周左右,觀察其健康情況。
2.抗原的準備:免疫抗原有多種選擇,一般采用滅活的病原體,也可以選擇激素類、蛋白類物質,使用前可以選用弗氏*佐劑乳化抗原。
3.動物免疫:免疫方式主要有口鼻接種、皮內接種、皮下接種、肌肉注射、腹腔注射以及靜脈注射。禽類的免疫方式多用肌肉注射,接種中采用胸肌多點注射。使用弗氏*佐劑充分乳化抗原。以商用雞新城疫滅活苗免疫為例,首.次免疫的劑量可以控制在1~2 mL,抗原含量為0.3-0.5 mg/kg(30日齡的蛋雞免疫劑量為0.4 mg/次)2周后進行2次免疫,4周后第3次免疫之后每隔1個月可加強免疫1次。
4.免疫雞血清抗體效價檢測:一般使用瓊脂免疫擴散實驗檢測免疫雞血清中的抗體效價。將免疫蛋雞所用的抗原滴加于抗原孔,免疫雞血清滴加于抗體孔。抗原孔與抗體孔之間出現沉淀線者,為陽性。最高稀釋倍數血清孔出現沉淀線,即為該血清的抗體效價。一般效價達到1:64以上時,可開始收集免疫蛋雞所產雞蛋。
5.收集卵黃抗體:先用清潔水洗去蛋殼表面的糞污,再使用碘酊和酒精消毒。無菌條件下打開胚殼,傾出蛋黃至滅菌大燒杯中,以1:9的比例加入滅菌生理鹽水或0.01 mol/L pH7.2 PBS稀釋并充分混勻,調節pH至5.2,勻漿后的卵黃抗體可以進一步提純,也可加入0.01%硫柳汞或每毫升卵黃液加入青.霉素、鏈.霉素各1000單位進行防腐抑菌,搖勻后分裝于消毒好的瓶中,冷凍干燥保存或制成干粉利用。
6.IgY的純化:卵黃混合液反復凍融3次,6000 r/min離心30 min,分離出卵黃蛋白,加入終濃度0.07%的海藻酸鈉和0.02%的NaCl,振蕩,使海藻酸鈉充分溶解,靜置30 min,6000 r/min離心30 min,上清液調節pH到7.2,再依次用50%、33%、3%的飽和硫酸銨(pH 7.2)提取IgY,用 SephadexG-25脫鹽。
結果判定
對獲得的卵黃抗體進行的效價及活性測定,可采用免疫電泳實驗、瓊脂免疫擴散實驗、血凝抑制實驗、酶聯免疫吸附實驗等多種抗體檢測方法。