免疫熒光實驗的主要步驟包括細胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細胞片制備（通俗的說法是細胞爬片）是免疫熒光實驗的第一步，細胞片的質量對實驗的成敗至關重要，原因很簡單，如果發生細胞掉片，一切都無從談起。這一步關鍵的是玻片（Slides or Coverslips）的處理以及細胞的活力，有人根據成功經驗總結出許多有益的細節或小竅門，非常值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是根據所研究抗原的性質選擇適當的固定方法，合適的固定劑和固定程序對于獲得好的實驗結果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步驟是類似的，最重要的區別在于免疫熒光實驗中要用到熒光抗體，因此必須謹記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更加關鍵。最后需要注意的是，標記好熒光的細胞片應盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結果。
由于操作步驟比較多，同時在分析結果時無法像WB那樣可以根據分子量的大小區分非特異性識別，所以要得到一個免疫熒光實驗結果，除了需要高質量的抗體，以及對實驗條件進行反復優化外，還必須設立嚴謹的實驗對照。總之，免疫熒光實驗從細胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到最后的封片及觀察拍照，每步都非常關鍵，需要嚴格控制實驗流程中每個步驟的質量，才能最終達到你的實驗目的。
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