PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種分子生物學(xué)技術(shù)，現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于臨床和實(shí)驗(yàn)室，用于擴(kuò)增特定的DNA片段。它的基本原理就是在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的條件，最終完成特定基因的體外復(fù)制。PCR實(shí)驗(yàn)基本由變性、退火、延伸三個(gè)步驟完成。
1.變性。變性的目的是使模板DNA雙鏈解旋成為單鏈以便與引物結(jié)合，通常給它加溫至95℃（這是Taq酶進(jìn)行30個(gè)左右的循環(huán)后活力不致受到過多損失時(shí)能耐受的最高溫度）。模板的變性對(duì)PCR成功與否至關(guān)重要，第一輪循環(huán)中變性時(shí)間往往為10min，然而根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在其他各次的循環(huán)中一般以95℃持續(xù)30s（變性時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)損害酶活性）足以使各種模板變性。當(dāng)模板的G+C含量超過55%時(shí)則需要更高的變性溫度，可以選用來源于古細(xì)菌的DNA聚合酶，因?yàn)樗萒aq酶更能耐受高溫。
2.退火。模板變性成單鏈后，溫度快速降至退火溫度，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列可發(fā)生結(jié)合。退火溫度的選擇也至關(guān)重要，如果退火溫度太高，那么引物就無法與模板很好地結(jié)合，進(jìn)而就會(huì)影響擴(kuò)增效率；如果退火溫度太低，引物則會(huì)產(chǎn)生非特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致非特異性DNA片段的擴(kuò)增。退火30-60s便可使引物與模板之間結(jié)合。
3.延伸。模板-引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，沿著5’→3’的方向合成一條與模板DNA鏈互補(bǔ)的鏈。延伸時(shí)的溫度通常為72℃（Taq酶的最適溫度為72℃-78℃）。在最適溫度下，Taq酶的聚合速率約為2000bp/min。不過靶基因的每1000bp的擴(kuò)增產(chǎn)物的延伸時(shí)間的設(shè)計(jì)時(shí)長(zhǎng)為1min。另外，延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，甚至在所擴(kuò)增目的基因的長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略。
重復(fù)循環(huán)“變性→退火→延伸"過程就可獲得更多的半保留復(fù)制鏈，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-10min可使引物延伸，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。
400-0918-500
